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石斑鱼源性成分探针法荧光定量PCR试剂盒反应流程常规程序

2023-03-15
石斑鱼源性成分探针法荧光定量PCR试剂盒反应流程常规程序:

将PCR反应所需的成分配置完后,在PCR仪上于94-96℃预加热几十秒至几分钟,使模板DNA充分变性,然后进入扩增循环。在每一个循环中,先于94℃保持30秒钟使模板变性,然后将温度降到复性温度(一般50-60℃之间),一般保持30秒钟,使引物与模板充分退火;在72℃保持1分钟(扩增1kb片段),使引物在模板上延伸,合成DNA,完成一个循环。重复这样的循环25~35次,使扩增的DNA片段大量累积。最后,在72℃保持3-7min,使产物延伸完整,4℃保存。

2.复性(退火)和延伸温度

复性的温度是PCR扩增是否顺利的关键因素,通常在50-60℃之间。具体的温度主要由引物的Tm值决定。延伸温度绝大多数设定为72℃。如果复性的温度很高,可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度,变成二步法PCR。

3.反应时间

变性步骤一般使用30秒钟,如果模板的G+C含量较高,或直接用细胞做模板,变性时间可适当延长。复性时间有30秒种一般是足够的。延伸时间由扩增产物的大小决定,一般采用1kb用1分钟来保证充足的时间。

4.循环次数

循环次数主要与模板的起始数量有关,在模板拷贝数为104~105数量级时,循环数通常为25~35次。

平台效应(plateaueffect):PCR扩增过程后期会出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。原因:底物和引物的浓度已经降低,dNTP和DNA聚合酶的稳定性或活性降低,产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用,非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用,扩增产物自身复性,高浓度扩增产物变性不彻底。

5.PCR反应液的配制

PCR反应体系的配置方式有时也会影响反应的正常进行。常规方法与其它酶学反应一样,在最后加入DNA聚合酶。早期的PCR仪没有带加热的盖子,要求在反应液上覆盖一层矿物油,防止水分蒸发。

对于使用具3’-5’外切活性的高温DNA聚合酶时,有时会扩增不出产物。在遇到这个问题时,如果将反应成分分开配制,A管含模板、引物和dNTP,以及调整体积的H2O,B管含缓冲液、DNA聚合酶和水,然后再将两管溶液混合起来,可较好地克服这个问题。

按照常规的方法配制反应体系,有时会出现非特异性扩增的问题。热启动(hotstart)PCR操作方式可较好解决这一问题。将dNTP、缓冲液,Mg2+和primer先配制好,然后加入一粒蜡珠(如AmpliWaxPCRQam100),加热熔化,再冷却,使蜡将溶液封住,最后加入模板和DNA聚合酶等剩余成分。只有当PCR反应进入高温阶段后,蜡层熔化,所有反应成分才会混合在一起。

 獐牙菜苦甙 英文名称: Swertiamarin CAS号: 17388-39-5 分子式: 374.34 分子量:
 异鼠李素 英文名称: Isorhamnetin CAS号: 480-19-3 分子式: 316.26 分子量:
 异欧前胡素 英文名称: Hu Su in front of the same CAS号: 482-45-1 分子式: 270.28 分子量:
异牧荆素 英文名称: Different animal husbandry CAS号: 29702-25-8 分子式: 432.38 分子量:
 异茴芹内酯 英文名称: Isopimpinellin CAS号: 482-27-9 分子式: 246.22 分子量:
 异荭草苷 英文名称: Isoorientin CAS号: 分子式: 分子量:
 异补骨脂查尔酮 英文名称: ISO bavachalcone CAS号: 分子式: 分子量:
 异补骨脂二氢黄酮 英文名称: Isopsoralenin two flavanones CAS号: 分子式: 分子量:
 乙酸龙脑酯 英文名称: Bornyl acetate CAS号: 20347-65-3 分子式: 196.29 分子量:
 野黄芩素 英文名称: Wild Radix et CAS号: 529-53-3 分子式: 286.24 分子量:
 灯盏花乙素 英文名称: Flower B CAS号: 27740-01-8 分子式: 462.37 分子量: