? 1000ul 、100ul 、10ul 、2.5ul 移液器

实验操作细则：

一、 样本处理：
1.   取 100ul 待检样本至 1.5ml 干净的离心管中，加入 10ul 5M  NaCl  溶液，用涡旋      振 荡器充分震荡 10 秒；
2.   加入 10ul 蛋白酶 K，在涡旋振荡器上充分震荡 10 秒；
3.   配制新鲜的裂解液，其组成为： 130ul  裂解液/100ul  样本， 9ul  肝糖原/100  样本， 0.2ul tRNA/100ul 样本，充分混匀以制成新鲜配制的裂解液；
4.  将 139ul 新鲜配制的裂解液加入到样本管中， 然后用涡旋振荡器充分震荡 10 秒， 取出短 暂快速离心 5 秒，然后放置在 56oC 孵育 30 分钟；
二、 DNA 捕获：
1.     将磁珠充分涡旋振荡以完全重悬；
2.     将样本管从孵育器中取出， 进行简短的离心，将液体收集到管底，然后加入完全重悬的 磁珠 60ul 和 230ul 结合液，在涡旋振荡器上充分震荡 10 秒； (注意： 在加入磁珠时， 需经 常振荡重悬磁珠， 以保证吸取时磁珠的均匀性。建议每加 3-4 组样本后， 重悬磁珠后再进行 后续样本的添加)
3.     将震荡后的样本管，置于旋转混匀器或涡旋振荡器上 10 分钟以进行磁珠捕获；
4.     将样本管从旋转混匀器上取下，在 10000g 的条件下离心 1 分钟使磁珠充分聚集；
5.     将离心后的样本管置于磁力架上， 待溶液完全澄清后， 用枪头小心移去上清(注： 避免 枪头搅动磁珠，使得磁珠同上清一起被除去从而影响得率)；
三、 洗涤：
1.     样本管移去上清后，不必将样本管从磁力架上取下，直接加入 400ul 洗涤液；
2.     待溶液完全澄清后，磁珠完全分离，用枪头小心移去上清；


3.     保持样本管在磁力架上， 加入 400ul 洗涤液， 待溶液澄清， 磁珠完全分离后， 用枪头小 心移去上清；
4.     将样本管从磁力架上取下， 于 10000g 的条件下离心 30 秒，使得残留的洗涤液完全聚集 到管底；
5.     将样本管置于磁力架上，待磁珠完全分离后，用 10ul 枪头小心移除残留的液体；
6.     将样本管从磁力架上取下，置于 70oC 金属浴中，放置 4 分钟， 除去残留的乙醇(注： 若干燥不够， 残留的乙醇会影响后续的定量检测反应)；待磁珠团出现裂纹时，将样本管从 金属浴中取出进行 DNA 洗脱；
四、 DNA 洗脱：
1.     沿着样本管的管壁加入 50- 100ul 洗脱液，用 100ul 的枪头反复吹吸，以完全重悬磁珠；
2.     将样本管置于 70oC 孵育器孵育 10 分钟；
3.     将样本管从孵育器中取出，于 20000g 离心 2 分钟，然后至于磁力架上，待磁珠完全分 离后，用 10ul 枪头小心将上清液体转移至新的干净的离心管中；
4.      为了避免吸入磁珠，在离心管中还剩余少量液体时，将其于 20000g 离心 2 分钟，然后 至于磁力架上以吸出剩余的液体。



注意事项：

1.   在结合操作时请确保磁珠与样本充分混匀，建议使用混匀仪或涡旋振荡器。
2.   洗涤操作后如果管底残留有液体，请再次短暂离心后放于磁力架磁性分离，用小枪头吸 出洗涤液。
3.   每次操作请勿吸出磁珠，保证磁珠加入后一直在管中，只操作上清。